Interferência no teste de endotoxinas: seus acessórios são confiáveis?
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Atualizado: há 5 dias
Anteriormente, abordamos os interferentes provenientes das amostras que podem comprometer os resultados do teste de endotoxinas bacterianas. Esses interferentes geralmente são superados por diluição ou tratamento da amostra.
Entretanto, há outro fator crítico que não depende da amostra: os acessórios utilizados.
Água, ponteiras e tubos são empregados no preparo da curva padrão (em testes fotométricos), no preparo dos controles, nas etapas de diluição e preparo das amostras. A escolha inadequada desses materiais pode gerar interferências relevantes no ensaio. A seguir, conheça os principais acessórios que merecem atenção.
Água apirogênica
A água é um elemento crítico, utilizada em todas as partes de preparo do teste e, portanto, devemos escolher com cautela a água utilizada. A água para injetáveis, por exemplo, deve ser estéril e apresentar níveis de endotoxinas inferiores a 0,25 EU/mL. Já a água apirogênica deve conter o menor nível possível de endotoxina e, por excelência, também ser estéril.
Uma água estéril nem sempre é apirogênica, pois a esterilização elimina microrganismos, mas não necessariamente endotoxinas. A endotoxina é componente estrutural da parede celular de bactérias Gram-negativas e é liberada durante a lise celular, seja por morte ou multiplicação bacteriana.
A água apirogênica da Associates of Cape Cod Inc., por exemplo, apresenta concentrações inferiores a 0,001 EU/mL, conforme Certificado de Compliance. Mesmo com reagentes ou curvas de alta sensibilidade, essa água não interfere no teste por adição de endotoxina.
É importante lembrar que a endotoxina possui efeito acumulativo. Pequenas quantidades presentes na amostra, na água ou em outros acessórios, como tubos e ponteiras, podem se somar e reagir com o LAL, gerando resultados positivos.
Por isso, a água utilizada deve possuir certificado que comprove níveis extremamente baixos de endotoxina, garantindo a confiabilidade do ensaio.
Tubos
Os tubos são utilizados tanto para diluição quanto para reação, estando presentes no preparo de controles, curvas e amostras. Tubos de diluição podem ser de vidro ou plástico; tubos de reação são exclusivamente de vidro. O material é determinante, pois alguns apresentam maior afinidade com endotoxina.
A endotoxina possui alta capacidade de adsorção a superfícies. Pode aderir ao material, sendo “sequestrada” durante o preparo da amostra e deixando de ser detectada na análise. Por esse motivo, recomenda-se vidro borossilicato e, entre os plásticos, poliestireno.
O borossilicato tipo I é considerado padrão-ouro, devido à baixa interferência em testes quantitativos e à facilidade de despirogenização por calor seco.
Já entre os plásticos, os mais utilizados são poliestireno e polipropileno. O poliestireno é amplamente empregado na fabricação de tubos e, em geral, é adequado para diluições. O polipropileno deve ser evitado para fabricação de tubos, pois pode causar inibição significativa por adsorção da endotoxina à parede do material. É frequentemente utilizado na confecção de ponteiras, onde o contato com a amostra é mais breve.
Além da adsorção, plásticos podem liberar compostos do processo de fabricação, como plastificantes e agentes de desmoldagem, que podem ser lixiviados para a amostra e inibir a reação do LAL.
Quanto à reutilização de tubos de vidro por despirogenização em calor seco, embora reconhecida pela Farmacopeia, exige cautela. A despirogenização reduz os níveis de endotoxina, mas não os restabelece aos níveis originais de um tubo novo. A estufa deve estar validada e, diante de resultados inesperados, recomenda-se utilizar tubos novos no reteste.
A dimensão também é relevante. A Farmacopeia Brasileira orienta tubos de diluição com 10 × 75 mm, considerando a formação adequada do coágulo. Tubos maiores podem dificultar a formação, enquanto tubos menores podem favorecê-la excessivamente, comprometendo a confiabilidade.
Ponteiras
No caso das ponteiras para micropipetas, a presença de filtros é um fator crítico. Ponteiras destinadas ao teste de endotoxinas não devem conter filtros de plástico nem de celulose.
Filtros de plástico podem "sequestrar" endotoxina ou liberar componentes que inibem a reação do LAL. Já filtros de celulose introduzem um interferente muito conhecido: o β-glucano.
O β-glucano presente na celulose pode ser liberado durante a pipetagem e ativar a cascata de coagulação do LAL, gerando resultados positivos que não decorrem da presença aumentada de endotoxina.
É importante certificar-se que as ponteiras utilizadas para o teste acompanhem certificado e sejam livres de filtros que possam levar a testes fora de especificação.
Um olhar além da amostra
Acessórios inadequados podem causar resultados não conformes, tanto positivos quanto negativos, ou comprometer a repetibilidade do ensaio. Tubos com dimensões incorretas ou submetidos à despirogenização podem afetar a reprodutibilidade. Ponteiras com filtro podem causar interferências diretas.
Em casos de reteste, é fundamental avaliar todos os acessórios envolvidos e o tipo de interferência observada. A confiabilidade do teste de endotoxinas depende não apenas da amostra e do reagente, mas também da adequação de cada material utilizado no processo.
Referências:
Novitsky, T. J. Glitches with Glass. LAL Update, v. 9, n. 2, p. 1–3, June 1991. Associates of Cape Cod, Inc.
Novitsky, T. J. The Problems with Plastics. LAL Update, v. 6, n. 3, p. 1–4, September 1988. Associates of Cape Cod, Inc.
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