4 dicas práticas para um teste de endotoxina mais robusto
- 7 de abr.
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Uma prática adequada no teste de endotoxinas é fundamental para garantir resultados robustos e com repetibilidade. Nos testes fotométricos, como turbidimétrico, quantitativo ou recombinante, garantir uma pipetagem correta e uma boa agitação é essencial. Mesmo no gel clot, que é mais robusto a esses interferentes, essas práticas fazem diferença significativa.
Neste texto, vamos abordar práticas que podem interferir no teste de endotoxinas e como buscar uma execução com excelência.
Pipetagem
A pipetagem correta é um dos principais pontos no teste de endotoxina. Utilizamos a ponteira em todos os processos: reconstituição de reagente e do controle padrão de endotoxina, preparo de curva padrão, diluições seriadas do controle e das amostras e preparo dos tubos com as análises. A pipetagem está presente em todas as etapas e pode gerar grandes impactos nos resultados.
As micropipetas possuem, em geral, dois estágios: o primeiro estágio, no qual se aspira o volume selecionado, e o segundo estágio, que garante a dispensa total do volume aspirado. É fundamental que esse manuseio seja realizado corretamente, pois no teste de endotoxinas sempre trabalhamos com volumes muito pequenos, e quaisquer diferenças podem trazer impactos visíveis.
Além da mecânica própria da micropipeta, que merece atenção, uma prática é essencial para melhorar a repetibilidade dos resultados: a lavagem da ponteira. Como abordado no texto sobre interferentes nos acessórios, as ponteiras são de plástico e a endotoxina possui grande capacidade de adsorção nesse tipo de material. Quando aspiramos um conteúdo, para garantir o arraste adequado da endotoxina, é importante realizar a lavagem da ponteira, que consiste em aspirar e dispensar aproximadamente três vezes o líquido do tubo na própria ponteira, assegurando que toda endotoxina pipetada seja transferida ao novo tubo.
Essa prática é particularmente relevante em testes quantitativos. Os softwares utilizam o critério chamado Coeficiente de Variação, que mede a porcentagem de variação entre cada réplica. A lavagem da ponteira melhora substancialmente esses coeficientes tanto para amostras, quanto para a curva-padrão.
Agitação
A endotoxina possui altíssima capacidade de adsorção a superfícies. Ao permanecer em repouso em um recipiente, ela tende progressivamente a aderir às paredes do frasco. Por esse motivo, a agitação adequada é fundamental para garantir que controles e diluições estejam sempre bem homogeneizados.
Ao preparar uma curva, tanto nos métodos fotométricos quanto no gel-clot, realizamos diluições seriadas a partir do frasco de controle padrão de endotoxina secundário (CPE). A cada etapa da diluição, é essencial que o tubo seja agitado por cerca de um minuto em vórtex, formando um pequeno redemoinho interno, garantindo que a endotoxina introduzida na água seja corretamente diluída.
Sempre que o tubo permanecer em repouso, refaça a agitação por no mínimo 30 segundos para assegurar a completa homogeneização.
A endotoxina da Associates of Cape Cod, Inc. possui concentração de 0,5 ug por vial, o que confere maior estabilidade durante o armazenamento. Quanto menor a concentração de endotoxina, maior será sua susceptibilidade a perdas por adsorção. Por isso, a agitação correta do frasco original é fundamental para evitar a ausência de endotoxina e resultados negativos decorrentes da falta dela.
Manuseio
A contaminação por endotoxina ocorre por contato. Durante a execução do teste, é fundamental evitar o contato de qualquer material não apirogênico com amostras e acessórios apirogênicos.
Por exemplo, a base da micropipeta não é apirogênica, apenas a ponteira. Ao pipetar, deve se evitar que a base da micropipeta encoste nas paredes internas do tubo apirogênico ou do frasco de água. Incline o tubo e mantenha a pipeta em aproximadamente 45 graus para garantir uma pipetagem segura. Outra prática importante para proteger o frasco de água apirogência de contaminação é evitar pipetar diretamente dele: fracione um volume de água em um tubo apirogênico e pipete dele. Dessa forma, quaisquer contaminações no manuseio não afetará todo o frasco de água, que permanecerá apirogênico.
A bancada, as luvas e o jaleco estão naturalmente expostos a endotoxinas presentes no ambiente. Durante a execução do teste, evite tocar na borda superior do tubo e tenha cuidado para que luvas e jaleco não entrem em contato com tampas, água, tubos e ponteiras.
Armazenamento
O reagente LAL é altamente sensível à temperatura e, portanto, seu armazenamento correto é um critério crítico. É importante certificar-se de que todas as orientações do fornecedor estão sendo seguidas adequadamente, evitando exposição a temperaturas inadequadas que possam comprometer sua capacidade de reação.
Os reagentes Pyrotell® e Pyrotell®-T, por exemplo, após serem reconstituídos, podem ser refrigerados por até 24 horas, ou podem ser mantidos congelados a temperatura inferior a -20°C por até 90 dias. Realizar o acompanhamento adequado das temperaturas de refrigeradores e freezers é fundamental para garantir que a sensibilidade do reagente não seja afetada.
A endotoxina, embora menos sensível à temperatura, também deve ser armazenada conforme as orientações do fabricante, a fim de evitar degradação e perda de concentração.
Uma prática segura e pensada para o teste de endotoxinas irá melhorar substancialmente a performance do teste, trazendo mais segurança e repetibilidade para a rotina laboratorial.
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